LRRK2-IN-1 CAS 1234480-84-2 فعالیت بیولوژیکی

درونکشتگاهی

انتقال نوع از نوع وحشی و G2019S منجر به 2.5 برابر سیگنال TR-FRET بالاتر می شود که می توان از طریق آن مهار شدLRRK2-IN-1به طور وابسته به دوز با مقادیر IC50 از 0.08 میکرومولار و 0.03 میکرومول به ترتیب [1]. LRRK2-IN-1 دارای IC50 از 45 نانومتر برای مهار DCLK2 و نمایشگاه IC50 بزرگتر از 1 میکرومولار است که در سنجشهای بیوشیمیایی برای AURKB ، CHEK2 ، MKNK2 ، MYLK ، NUAK1 و PLK1 ارزیابی می شود. LRRK2-IN-1 برای مهار MAPK7 با EC50 160 نانومتر تأیید شده است. LRRK2-IN-1 باعث مهار وابسته به دوز فسفوریلاسیون Ser910 و Ser935 همراه با از بین رفتن 14-3-3 اتصال به هر دو نوع وحشی LRRK2 و LRRK2 [G2019S] به طور پایدار در سلولهای HEK293 می شود [2]. LRRK2-IN-1 نسبتاً سمیت سلولی با IC50 از 49.3 میکرومولار در سلولهای HepG2 است. LRRK2-IN-1 به ترتیب در حضور و عدم حضور S9 در 15.6 و 3.9 میکرومولار سمیت سلولی را نشان می دهد [3]. LRRK2-IN-1 تکثیر ، مهاجرت را مهار می کند و باعث مرگ سلولی با مشخصه های آپوپتوز سلولهای HCT116 و AsPC-1 می شود.

در داخل بدن

LRRK2-IN-1 (100 میلی گرم بر کیلوگرم ، IP) باعث ایجاد دفسفوریلاسیون LRRK2 در کلیه موش ها می شود [2]. تزریق صفاقی LRRK2-IN-1 (100 میلی گرم بر کیلوگرم) منجر به کاهش معنی داری در حجم تومور و وزن زنوگرافهای توموری AsPC-1 می شود [4].

سنجش کیناز

فعال GST-LRRK2 (1326-2527) ، GST-LRRK2 [G2019S] (1326-2527) ، GST-LRRK2 [A2016T] (1326-2527) و GST-LRRK2 [A2016T + G2019S] (1326-2527 ) آنزیم با گلوتاتیون سفاروز از سلول لیزات HEK293 36 ساعت پس از ترانسفکسیون موقت سازه های cDNA مناسب خالص می شود. سنجش پپتید کیناز ، که به صورت تکراری انجام می شود ، در حجم 40 میکرولیتر حاوی 0.5 میکروگرم LRRK2 کیناز تنظیم شده است (که تقریباً با خلوص 10٪ غلظت نهایی 8 نانومتر) را در 50 میلی متر تریس / هیدروکلراید ، pH 7.5 ، 0.1 میلی متر تنظیم می کند. EGTA ، 10 mM MgCl2 ، 20 میکرومولارکتین نیتیدید ، 0.1 میکرومولار [γ-32P] ATP (500 cpm / pmol) و غلظت های مشخص شده از مهار کننده حل شده در DMSO. پس از انكوباسي به مدت 15 دقيقه در دماي 30 درجه سانتيگراد ، واكنش ها با مشاهده 35 ميلي ليتر مخلوط واكنش بر روي كاغذ فسفو سلولز P81 و غوطه ور شدن در 50 ميلي مولار اسيد فسفوريك خاتمه مي يابند. نمونه ها به طور گسترده شسته می شوند و اختلاط [γ-32P] ATP در نکتید با شمارش سرنکو اندازه گیری می شود. مقادیر IC50 با استفاده از آنالیز رگرسیون غیر خطی با منشور GraphPad محاسبه می شود.

سنجش سلول

سلول ها (104 سلول در هر چاه) در یک قطعه کشت بافت چاه 96 به صورت سه گانه قرار می گیرند. سلولها در حضور LRRK2-IN-1 با DMSO به عنوان وسیله نقلیه در 0 ، 0.31 ، 0.63 ، 1 ، 2 و 5 ، 10 و 20 میکرومولار کشت می شوند. پس از 48 ساعت پس از درمان ، 10 میکرولیتر از TACS MTT معرف به هر چاه اضافه شده و سلول ها در 37 درجه سانتیگراد انکوبه می شوند تا رسوب بلوری تیره در سلولها قابل مشاهده باشد. 100 میکرولیتر از 266 میلی متر NH4OH در DMSO سپس به چاه ها اضافه می شود و به مدت 1 دقیقه در یک بشقاب بشقاب قرار می گیرد. پس از تکان دادن ، صفحه اجازه داده می شود تا 10 دقیقه از نور محافظت شده جوجه کشی کند و OD550 برای هر چاه با استفاده از میکروپلیت خواننده خوانده شود. نتایج به طور متوسط ​​و به عنوان درصدی از کنترل DMSO (وسیله نقلیه) محاسبه می شود {23 calculated} / - خطای استاندارد میانگین.

مدیر حیوانات

LRRK2-IN-1در Captisol حل می شود و با تزریق داخل صفاقی به موش های نر نوع C57BL / 6 با دوز 100 میلی گرم در کیلوگرم تزریق می شود. موش های کنترل با حجم مساوی کاپتیسول تزریق می شوند. در نقاط زمانی 1 و 2 ساعت ، موش ها با دررفتگی دهانه رحم خاموش می شوند و بافت کلیه و مغز به سرعت در نیتروژن مایع جدا شده و به طور فوری منجمد می شوند.

منابع

[1] هرمانسون SB ، و همکاران. غربالگری برای مهارکنندگان رمان LRRK2 با استفاده از سنجش سلولی TR-FRET با توان بالا برای LRRK2 Ser935 Phosphorylation.PLoS One. 2012؛ 7 (8): e43580. Epub 2012 28 آگوست.

[2] دنگ ، شیانمینگ ، و دیگران. خصوصیات مهار کننده انتخابی پارکینسون&# 39 ؛ بیماری کیناز LRRK2. زیست شناسی شیمیایی طبیعت (2011) ، 7 (4) ، 203-205.

[3] Koshibu K ، و همکاران. جایگزین برای LRRK2-IN-1 برای مطالعات دارویی بیماری پارکینسون&# 39؛ داروسازی. 2015؛ 96 (5-6): 240-7.

[4] Weygant N ، و همکاران. مهار کننده مولکول کیناز کوچک LRRK2-IN-1 فعالیت مهمی را در برابر سرطان روده بزرگ و لوزالمعده از طریق مهار کیناز شبیه به تری بلکورتین نشان می دهد 1. سرطان مول. 2014 مه 6؛ 13: 103